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化学发光试剂印迹膜制备,按常规方法完成SDS-PAGE和电转膜操作,适当的封闭非常重要.可以通过标记一抗或二抗的手段引入HRP,一般采用市售的HRP二抗交联物.仔细地淋洗对于降低背景非常重要,在与HRP交联物温育后,膜片更需仔细洗涤,所有步骤均在室温下完成.化学发光试剂的配置,在使用前等量混合A液和B液,混合后尽快使用.将膜片置混合液中于室温下振荡温育2分钟,每平方厘米膜片至少使用0.1-0.2ml以覆盖全膜片.蛋白信号显现.
用平头镊钳住膜片,垂直置于吸水纸以吸去过量试剂.置膜片于二层保鲜膜之间，小心赶尽气泡.将膜片吸附蛋白面朝上,置于X光片盒中.于暗室中压上X光片.根据信号的强弱适当调整曝光时间,一般为1min或5min，也可选择不同时间多次压片，以达zui佳效果。显影冲洗.调节曝光时间,再次曝光显影.
化学发光试剂操作注意,本试剂每个批号均独立优化,请不要混用或稀释本试剂以免降低敏感性.加入一抗后膜不能再干燥.适当地封闭和洗涤膜片至关重要.使用前配置化学发光试剂，配置足够覆盖膜片即可,弃去使用过的混合试剂.使用干净取样头取用每种试剂.*张片子建议曝光1分钟，观察结果后判断zui佳曝光时间可从30秒至2小时不等.除了放射自显影片曝光和洗片处理外,所有步骤均不必在暗室中操作,膜片可经适当方法洗脱原有抗体,再次印迹使用,在此情况下,此试剂更为理想.因为它不象生色物质需要从膜片上清除底物.NaN3能抑制HRP活性,应避免使用NaN3.
化学发光试剂用途,本试剂是非放射性发光系统,用于检测固定在膜上的蛋白,其敏感性达1-5pg.用X光片可快速地获得*的硬拷贝结果.所含独特的底物足以维持12小时以上的发光,便于反复曝光操作,免疫印迹膜经抗体脱卸处理后可供再次抗体探查使用。适用于痕量蛋白或核酸检测。特别节省抗体(一抗1:500-1:5000，二抗1:3000-1:10000)。原理,辣根过氧化酶使试剂中的发光物（Luminol）氧化并发光，而试剂中含有增强剂这使得发光增强了1000倍。在免疫印迹中，将复杂的蛋白混合物经SDS-PAGE分离，并转移到固相膜上（如NC、PVDF）等，用于免疫学检测，经HRP标记的抗体与膜上的蛋白直接（标记一抗）或间接（标记二抗）反应。当加入免疫印迹化学发光试剂后，Luminol发生氧化降解，并发射波长为428nm的光，此光可经X光胶片(放射自显影片)感光记录下来。
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